Цивилизация
Эмбриологическими исследованиями в каком-то смысле занимался даже Аристотель, изучавший развитие птичьих яиц. И хотя современная теория индивидуального развития сформировалась лишь в конце XIX века, именно двум тысячам лет истории эмбриологии мы обязаны полноценными «научными» ответами на когда-то «философские» (в худшем смысле этого слова) вопросы о зарождении жизни.
Благодаря эмбрионам мы узнали о существовании программируемой клеточной гибели и направленной миграции. Вершиной же практического применения этой науки, несмотря на многочисленные этические протесты, стало экстракорпоральное оплодотворение и выделение эмбриональных стволовых клеток.
Переход эмбриологии на новый этап развития каждый раз был связан непосредственно с техническим оснащением лаборатории. Сначала вместе с термостатируемыми столиками появилась возможность наблюдать развитие прямо под микроскопом. Потом на смену карандашу, которым пользовался ещё нобелевский лауреат 2002 года по физиологии и медицине Джон Салстон, пришли фото- и видеокамеры — сначала аналоговые, а потом и цифровые. Наконец, на смену обычному рассеянию света пришла флуоресценция, микроманипуляторы сделали возможным внедрение ядер в клетки, а вирусные «векторы» – отдельных генов в находящиеся в ядрах ДНК.
Объединив всё вышеупомянутое и помножив на немецкую скрупулезность, Филипп Келлер и его коллеги
смогли проследить за каждой клеточкой, развивающейся из единственной зиготы модельной рыбки данио (Danio rerio) до состояния зародыша из 20 тысяч клеток – за их появлением, перемещением и делением.
Поскольку в своём эмбриональном развитии люди также проходят стадии, соответствующие своим эволюционным предшествиям («онтогенез повторяет филогенез» по формулировке Геккеля), полученные результаты имеют некоторое отношение и к появлению человека.
Конечно, подобного рода попытки предпринимались и до сегодняшнего дня. Например, любимец генетиков круглый червь Caenorhabditis elegans прозрачен, неприхотлив с точки зрения условий и питания, и его эмбрионы отлично развиваются в лаборатории. Но одно дело 671 достаточно крупная клеточка червя за весь период наблюдения, и совсем другое – тысячи меньших по размеру клеток позвоночных, образующихся уже на первых часах развития.
Теперь представьте, что границы живого эмбриона и так неразличимы даже на большом увеличении микроскопа, так что о наблюдении отдельных клеток без окрашивания и говорить не приходится.
Тут на помощь Келлеру, как и его многочисленным коллегам в течение последнего десятилетия, пришёл ставший в минувшую среду «нобелевским» зеленый флуоресцирующий белок, GFP.
Ученые вставили кодирующий его ген в эмбрион данио, когда тот находился еще на одноклеточной стадии. Все клетки-потомки «икринки» тоже синтезировали белок, причем располагался он исключительно в области ядра, что позволяло легко различать отдельные клетки и даже отслеживать деления.
Теоретически наблюдать все это можно в обычный флуоресцентный или конфокальный микроскоп, но вот разрешающая способность, да и способность отслеживать динамику событий все равно остается недостаточной. Кроме того, конфокальный микроскоп, к примеру, требует достаточно высокой плотности световой энергии в исследуемой точке, которая может привести к повреждению клеток.
Авторам публикации в Science пришлось изобрести более подходящий для своей цели способ, причем не только в микроскопии, но и в обработке изображений.
За счет «возбуждающих» лазерных лучей, двигающихся как горизонтально, так и вертикально, ученые смогли добиться не только высокой разрешающей способности по всем трем осям, но и большей скорости сканирования. В среднем аппарат «анализировал» в секунду 63 миллиона вокселей – элементарных единиц объема (по аналогии с пикселем – элементарной единицы площади). В реальности каждый куб получался из примерно 400 цифровых снимков по 4 мегапикселя каждый (2048 столбцов по 2048 пикселей в каждом); эпизоды сканирования повторялись раз в минуту или полторы минуты.
Изображение, полученное с помощью лазерной сканирующей флуоресцентной тонколистовой микроскопии (так называется новый метод), доступно лишь в цифровом формате – в окуляры микроскопа ничего подобного увидеть невозможно. Отображаемая на мониторе картинка – результат «восстановления» информации компьютером.
Это восстановление по точкам стало для учёных вторым поводом для гордости. Благодаря специально разработанной компьютерной программе им удалось в течение 24 часов непрерывно отслеживать деление, миграцию и превращения тысяч клеток. Всего были получены свыше тысячи кубов данных по 63 миллиона вокселей в каждом. Каждый куб анализировался, по положению флуоресцирующих ядер на соседних кадрах идентифицировались отдельные клетки, их движение и, иногда, деление.
Конечным итогом стало создание «цифрового» эмбриона – компьютерной модели первых суток индивидуального развития, «усредненной» по семи исследованным эмбрионам.
Публике учёные представили три видеоролика, показывающие развитие эмбриона от стадии из чуть более сотни клеток через полтора часа после оплодотворения до уже хорошо различимого зародыша через сутки. На первом из роликов, вынесенном к заголовку статьи, цвета клеток кодируют скорости их перемещения. На втором цветом закодированы направления движения, на третьем синим цветом показаны новые клетки каждого кадра, а красным – только что «поделившиеся» (это разделение, конечно, условно). Обратите внимание на «пульсы» деления ещё почти не отличающихся клеток в самом начале роликов.
«Методологическая», на первый взгляд, работа принесла и первые научные результаты. Во-первых, Келлер смог разрешить вопрос о моменте формирования асимметрии, доказав, что это происходит на стадии 512-клеточного эмбриона. Вторая находка продемонстрировала все возможности метода: ученые точно отследили источник гипобласта, в дальнейшем дающего начало двум зародышевым листкам: мезодерме и эндодерме.
Безусловно, исследовательская группа в скором времени перейдет и к «теплокровным эмбрионам», но новых результатов от Келлера можно ждать и до этого: уже полученное «видео» хранит в себе огромное количество информации, достаточное для доброго десятка публикаций.