Контроль активности белков в организме – одна из важных задач биоорганической химии. Так, например, управление транскрипционными факторами – белками, отвечающими за перенос информации с молекулы ДНК на м-РНК, — позволит влиять на контролируемую ими морфологию клеток. Через белки можно управлять ответом организма на внеклеточные сигналы и изменение окружающей среды, а также процессами деления клеток и клеточными процессами старения. Однако исследования осложнены тем, что к ин-виво-контролю функции белков предъявляются очевидные дополнительные требования: воздействующие агенты должны быть безопасны для живого организма в целом. По этой причине относительно простые химические реакции, хорошо осуществляемые с белками in vitro, не подходят для перспективного медицинского применения: «малые» молекулы, используемые в них, например формальдегид, являются ядовитыми.
Из-за этого активация-деактивация ферментов с помощью света является предпочтительной, «бережной» методикой управления функцией белков. Исследование механизма модуляции активности рестрикционных ферментов с помощью ультрафиолетового или синего света публикует Proceedings of the National Academy of Sciences.
Рестриктазы — ферменты класса гидролаз, которые катализируют разрушение фосфодиэфирных связей (эти связи играют ключевую роль во всех биологических системах, образуя остов нуклеиновых кислот ДНК и РНК) чужеродных ДНК в большинстве прокариотических организмов — одноклеточных, не обладающих оформленным клеточным ядром, как, например, бактерии. Таким образом, рестриктазы выполняют своего рода «иммунную» функцию. Распознавание чужеродной ДНК осуществляется в специфических нуклеотидных последовательностях (сайтах), которые в собственной ДНК клетки «отмечены» определенными ферментами.
О результатах работы рассказала корреспонденту «Газеты.Ru» один из ее руководителей, заведующий отделом химии нуклеиновых кислот Института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского (НИИ ФХБ МГУ), доктор химический наук, профессор Татьяна Орецкая: «Один из возможных способов регулирования активности белков основан на введении в структуру последних «фотопереключателя», который позволяет изменить активность белка под действием света с определенной длиной волны. Это позволяет изменять активность белка в клетке без добавления химических реагентов, которые, кроме того, могут негативно влиять на клеточные процессы. Пока рано говорить о внедрении в практику предложенных нами подходов регулирования активности ферментов рестрикции при использовании в качестве «фотопереключателей» производных азобензола.
Однако в перспективе создание реагентов, которые способны модулировать активность клеточных белков, может привести к разработке биомедицинских препаратов нового поколения».
С помощью перекрестного сшивания остатков цистеина (аминокислоты, играющей важную роль в дезинтоксикационных процессах) в ферменте бифункциональным производным азобензола, которое может иметь как цис-, так и транс-конфигурацию в зависимости от длины волны света, которым его облучают (УФ или синего), активность фермента можно обратимо контролировать. При облучении синим светом азобензол находится в транс-конфигурации (фенильные заместители располагаются по разные стороны от двойной связи азот--азот), а в УФ-свете – в цис-конфигурации (заместители находятся по одну сторону от связи). Это позволяет изменить мотив упаковки конформационно подвижных цепей. Расстояние между SH-фрагментами цистеина значимо меняется (см. рисунок), что и позволяет модулировать функцию фермента.<3>
Таким образом, функция сшитых остатков цистеина варьируется при смене освещения с УФ на синее, проявляя так называемый «эффект фотопереключателя».
Чтобы выяснить, какие именно остатки наиболее значимо реагируют на изменение света, было синтезировано более 30 вариантов одноцепной рестрикционной эндонуклеазы PvuII. Затем их модифицировали азобензолом и протестировали их способность расщеплять ДНК.
Обычно одиночные перекрестные сшивки в ферменте вызывают лишь небольшие изменения его действия, а значимые эффекты наблюдаются лишь при большом количестве перекрестных сшивок. Некоторые модифицированные ферменты несут сшитый фрагмент в непосредственной близости от активного центра. Именно их лучше всего получается «переключать» с помощью света – интенсивность расщепления ДНК менялась в 16 раз, при этом оставаясь обратимой. При этом изменение активности фермента происходит за считанные секунды.
«Наша работа проводилась в рамках международного проекта International Research Training Group «Enzymes and Multienzyme Complexes acting on Nucleic Acids» («Ферменты и мультиферментные комплексы, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами»). Наш коллектив первый, работающий в рамках этой программы в России и в Германии. С немецкой стороны в нем участвуют два университета – Университет Юстуса Либиха (г. Гиссен) и Университет Филиппа (г. Марбург). С российской стороны наш коллектив состоит из семи команд: пять из МГУ имени М. В. Ломоносова (химический факультет и НИИ ФХБ имени А. Н. Белозерского) и две из Института биологии гена РАН. В программе участвуют 20 аспирантов и молодых кандидатов наук из России. В таком большом коллективе мы работаем третий год, и результатом одного из научных контактов стала эта публикация. Что касается самой программы, с немецкой стороны она финансируется DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Немецкое исследовательское общество), а с российской – РФФИ (Российским фондом фундаментальных исследований)», — объяснила профессор Орецкая.