Цивилизация
В научном сообществе уже сложился консенсус по отношению к стволовой терапии, с которой связывают будущие прорывы доказательной научной медицины. Между тем некоторые, когда-то казавшиеся перспективными, методы этой терапии уже признаны малоэффективными, как, например, инъекции стволовых клеток пациентам, о чем «Газета.Ru» уже писала. Проблемной остается и искусственная стимуляция активности стволовых клеток с помощью специальных препаратов, токсичность, нестабильность действия и высокая цена которых накладывает сильные ограничения на их использование. Обойти последние позволяет новая технология «приклеивания» молекул лекарств к инертному полимеру посредством облучения их смеси сфокусированным в наномасштабе потоком ускоренных электронов высоких энергий, разработанная российскими учеными в томском «НИИ фармакологии» Сибирского отделения РАМН. О сути этой технологии, открывающей новое перспективное направление в стволовой терапии, рассказывает в своей лекции один из ее ведущих разработчиков — доктор медицинских наук Глеб Зюзьков, недавно отмеченный премией международной издательской группы Elsevier как один самых цитируемых российских ученых.
Главная фармакологическая стратегия регенеративной медицины
Бурное развитие биомедицинской науки в области клеточных технологий позволило осуществить значительный прорыв в понимании биологии стволовых клеток — полипотентных клеток, то есть клеток, являющихся источником развития любых тканей организма. Наиболее изученной популяцией клеточных элементов во взрослом организме, обладающих уникальной способностью к самоподдержанию, а в случае необходимости — к миграции и хомингу в отдаленные органы (от англ. home (дом); под хомингом понимается способность молекул и клеток перемещаться в организме к определенным клеткам и тканям, или «мишеням») с их дальнейшей дифференцировкой во многие специализированные клеточные типы (см. справку) на сегодняшний день является популяция мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
Напомню, мезенхимой (от др.-греч. mesos — средний и eghymos — сочный) называют зародышевую соединительную ткань большинства многоклеточных животных и человека, из которой образуются соединительная ткань, кровеносные сосуды, главные мышцы, висцеральный скелет, пигментные клетки и нижний слой соединительнотканой части кожи.
В то же время после рождения организма в других органах также существуют элементы, обладающие высоким пролиферативным (то есть связанным с разрастанием тканей путем размножения клеток, от лат. proles — отпрыск, потомство и fero — несу) и дифференцировочным потенциалом. Это так называемые региональные клетки-предшественники, назначение которых, как и вышеназванных мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток, — обеспечение регенерации тканей в ответ на физиологическую убыль клеток либо их гибель, вызванную повреждающим фактором.
В совокупности полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности стволовых клеток привели к развитию нового направления в лечении многих заболеваний — клеточной терапии.
При этом наиболее физиологичным и рациональным подходом к решению задач регенеративной медицины является стимуляция функций именно эндогенных, то есть собственных, развившихся внутри организма, стволовых клеток, основанная на принципе подражания деятельности естественных регуляторных систем, обеспечивающих их функционирование. Собственно, в этом и заключается главная фармакологическая стратегия регенеративной медицины.
Целью исследований, проводимых на протяжении многих лет в ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, является разработка методов экспериментальной терапии различных заболеваний с помощью специальных веществ — модификаторов функций стволовых клеток и создание с использованием нанотехнологии электронно-лучевого синтеза средств для регенеративной медицины.
Научной основой, обеспечившей целесообразность проведения таких работ, явились результаты наших собственных фундаментальных исследований по изучению роли различных пулов клеток-предшественников в развитии и разрешении патологических процессов.
Недостаточность механизмов регенерации, связанных со стволовым клетками тканей-депо, и токсичность стимулирующих эти механизмы препаратов
Анализ данных, полученных на различных моделях патологических состояний (например, инфаркта миокарда, хронического гепатита, сахарного диабета, различных энцефалопатий, кожных ран), показал во всех случаях развитие практически однотипных реакций со стороны прогениторных клеток, что свидетельствовало о неспецифическом, то есть не связанном с разновидностью патологии, характере этих реакций (прогениторные клетки — это стволовые клетки, но в отличие от мультипотентных уже детерминированные на дифференцировку в определённый тип клеток, они имеют стойкие биомаркеры, уже позволяющие отличить их и их потомство от клеток других типов).
Также мы обнаружили, что независимо от характера повреждений имела место активация мультипотентных стволовых клеток гемопоэтической ткани — ткани, из которой в процессе пролиферации и дифференцировки формируются все прочие клетки крови (именно гемопоэтическая ткань представляет собой основное депо мультипотентных стволовых клеток в организме). Однако активация мультипотентных стволовых клеток гемопоэтической ткани не сопровождалась их мобилизацией в периферическую кровь — кровь, циркулирующую по сосудам вне кроветворных органов. Одновременно для компенсации вызываемых повреждений оказывалось недостаточным и повышение функциональной активности региональных предшественников органов-мишеней.
Эти данные позволили сотрудникам «НИИ фармакологии» сформулировать концепцию о недостаточности и несостоятельности механизмов регенерации, связанных со стволовым клетками тканей-депо.
С целью стимуляции миграционных процессов мультипотентных стволовых клеток мы вводили препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ).
В ходе экспериментов на моделях инфаркта миокарда, хронического гепатита, сахарного диабета, энцефалопатий различного генеза и кожной раны были выявлены в разной мере выраженные терапевтические эффекты данного вещества, которое относится к классу цитокинов — информационных молекул, регулирующих межклеточные и межсистемные взаимодействия, определяющих выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференциацию и функциональную активность. Механизмом его действия являлась стимуляция мобилизации мультипотентных стволовых клеток костного мозга и их миграция в органы-мишени с дальнейшей дифференцировкой либо в специализированные клеточные типы, либо в элементы, опосредованно ускоряющие течение репаративных процессов поврежденных тканей.
Кроме того, была предпринята попытка управления регенераторным потенциалом эндогенных стволовых клеток путем воздействия на межклеточный матрикс — внеклеточные структуры ткани, составляющие основу соединительной ткани и обеспечивающие механическую поддержку клеток и транспорт химических веществ. При этом наиболее значимых результатов удалось добиться при модификации свойств гиалуроновой кислоты (одного из основных компонентов межклеточного матрикса, связывающего стволовые клетки посредством специфических рецепторов) с помощью гиалуронидазы (см. справку).
Было выявлено, что относительно низкие дозы гиалуронидазы (1000 ЕД/кг) способны существенно повышать функциональную активность как мезенхимальных, так и кроветворных клеток-предшественников.
Выраженная же деградация гиалуроновой кислоты (за счет увеличения дозы гиалуронидазы до 5000 ЕД/кг), напротив, сопровождается нарушением их функционирования. Кроме того, введение гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг значительно усиливало мобилизующие стволовые клетки свойства гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Причем указанные сдвиги со стороны пула родоначальных клеток сопровождались закономерными изменениями картины костного мозга и периферической крови, заключающимися в стимуляции процессов кроветворения.
Это обстоятельство косвенно свидетельствует о высокой сопряженности всех этапов развития прогениторных элементов под влиянием гиалуронидазы (от предшественников до зрелых клеток).
К сожалению, белковая природа гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и гиалуронидазы определяет достаточно высокую их токсичность, что делает практически невозможным широкое применение этих лекарственных препаратов в клинике в качестве средств для регенеративной медицины, когда предполагается длительное, многократно повторяющимися курсами, введение фармакологического агента.
В то же время в связи с развитием нанотехнологий появилась уникальная возможность создания принципиально новых лекарственных средств.
Инновационные нанопрепараты на основе соединений органической природы, имитирующие естественные регуляторы
Замечу, что такие футуристические продукты нанотехнологий, как нанороботы, оснащенные бортовыми системами управления, связи, ориентации, наносенсорами и наноманипуляторами, способными работать внутри человеческого организма, безусловно, нельзя рассматривать даже как отдаленную, но обозримую перспективу.
В отличие от всего вышеперечисленного абсолютно реальной перспективой приложения нанотехнологий в практической фармакологии является использование различных специфических носителей фармакологически активных веществ, в том числе аналогов эндогенных, то есть свойственных самому организму, регуляторов функций.
В настоящее время известны и достаточно активно разрабатываются шесть основных нанотехнологических платформ в фармакологии, различающихся по физикохимической структуре создаваемых с их помощью конструкций:
— наносферы
— нанооболочки (представленные в основном липосомами)
— полимеросомы
— дендримеры
— полимерные мицеллы и конъюгаты
— полимер-лекарственное вещество.
Основными задачами создания нанотехнологичных лекарственных веществ во всех случаях является: преодоление тканевых барьеров, уменьшение побочных эффектов (токсичности, аллергенности) и повышение эффективности (в основном за счет увеличения времени жизни лекарственного препарата в организме). Кроме того, активно исследуется проблема обеспечения адресной доставки лекарственных веществ, которая, однако, в настоящее время далека от практического решения.
С точки зрения патофизиологии и токсикологии следует четко разграничивать наноконструкции на: (1) вещества, состоящие либо содержащие в своем составе неорганические компоненты; и (2) соединения, полученные с использованием субстанций исключительно органического происхождения.
Наночастицы первого типа, являющиеся наносферами, представляют наименьший интерес, так как несут наиболее серьезную потенциальную угрозу в связи с отсутствием в организме адекватных систем их биодеградации и выведения, что располагает к их значительному и неконтролируемому накоплению в тканях, а также повреждению субклеточных структур, в том числе и генетического аппарата клеток.
Иным образом обстоит дело с разработкой наноконструкций на основе соединений органической природы.
В этой области уже существуют большие достижения, представленные хорошо зарекомендовавшими себя в клинике конъюгированными (спаренными) с полимерами препаратами, в том числе на основе белков (пегасис, пегфилграстим, мирцера и др.). Данные препараты обладают большей стабильностью, растворимостью, более значительным периодом полувыведения из организма, чем их немодифицированные аналоги. Кроме того, «перекрытие» полиэтиленгликолем определенных участков этих белков делает их практически невидимыми для элементов системы иммунного надзора и значительно менее токсичными.
Во всех случаях для их получения применяется технология пегилирования химического синтеза, которая, несмотря на успешность ее использования, имеет и ряд существенных недостатков.
Поясним, что пегилирование представляет собой процесс, с помощью которого полиэтиленгликоль связывается c белковыми лекарственными препаратами посредством амино- или сульфгидрильной группы белка и химически активной группы (карбонатной, эфирной, альдегидной, трезилатной) молекулы полиэтиленгликоля. В процессе пегилирования происходит увеличение размера белка, что ведет к замедлению процесса его выведения через почки. Кроме того, белок получает защиту от ферментативного разрушения. В результате пегилированные белки обладают улучшенными фармакологическими свойствами — стабильностью, водорастворимостью, распределением, абсорбцием и пр. — по сравнению с непегилированными.
Химический синтез конъюгатов в «полимер-лекарство» является весьма сложным многоступенчатым и дорогостоящим технологическим процессом, с применением высокотоксичных реагентов, требующих использования многочисленных стадий очистки с целью получения гомогенной популяции модифицированных молекул.
В то же время существует нанотехнология радиационного (электронно-лучевого) синтеза (разработана совместно Институтом ядерной физики СО РАН, Институтом цитологии и генетики СО РАН и ООО «Саентифик фьючер менеджмент»), позволяющая получать практически нетоксичные и неиммуногенные белковые препараты. Более того, данные вещества оказываются еще в значительной степени защищенными от расщепляющих белки протеолитических ферментов (ферментов, играющих, в частности, важную роль в метаболизме), что делает возможным их эффективное пероральное использование.
В связи с этим ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН совместно с ООО «Саентифик фьючер менеджмент» с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза были разработаны нанотехнологичные модификаторы функций стволовых клеток: иммобилизированные на полиэтиленгликоле (пегилированные), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (имГ-КСФ) и гиалуронидаза (имГД).
В ходе исследований фармакологических свойств этих препаратов было показано наличие более выраженных (чем у немодифицированного цитокина) и продолжительных гранулоцитотворных свойств (гранулоциты — наиболее многочисленные представители лейкоцитов, их количество составляет большинство всех белых кровяных клеток).
Однако наиболее важной фармакологической особенностью имГ-КСФ является уникальность механизмов его действия. В частности, стимуляция процессов кроветворения под влиянием имГ-КСФ в отличие от таковой при использовании неконъюгированного аналога происходит в большей степени за счет активации «срочных» механизмов компенсации в результате воздействия препарата на «буферный отдел» регенераторного резерва гемопоэтической ткани с легко возобновляемыми ресурсами (так называемыми коммитированными клетками-предшественниками).
Таким образом, низкая степень вовлеченности элементов, определяющих «глубокий резерв» регенерации костного мозга – полипотентных стволовых кроветворных клеток — максимально снижает риск возможного истощения пула данных элементов и, как следствие, — «срыва» процесса адаптации.
Более того, влияние иммобилизированного препарата на детерминированные в развитии в гранулоцитарном направлении кроветворные прекурсоры в значительно большей мере, чем это наблюдается у непегилированного средства, затрагивает процесс их дифференцировки, а не пролиферативную способность.
Указанная специфика действия имГ-КСФ делает применение пегилированного фактора в ряде случаев более оправданным.
Особый интерес в плане использования данного средства в регенеративной медицине представляют его мобилизующие прогениторные клетки свойства.
В ходе экспериментов было обнаружено, что пегилированный цитокин (имГ-КСФ) стимулирует выход наиболее ранних родоначальных элементов, когда синтез основного фактора миграции SDF-1 клетками костного мозга снижен. При этом в клетках печёночной ткани синтез фактора SDF-1, который «притягивает» стволовые клетки, при введении пегилированной гиалуронидазы (имГД) возрастает в 2,3–3,2 раза. На модели хронического гепатита было показано, что при совместном использовании этих препаратов мобилизация стволовых клеток сопровождается их миграцией в орган-мишень с дальнейшей реализацией их ростового потенциала, определяющей в конечном итоге антисклеротическое и антихолестатическое действие лекарств (холестатический синдром — уменьшение поступления жёлчи в двенадцатиперстную кишку из-за нарушения её образования, экскреции или выведения вследствие патологических процессов).
Вместе с тем, наиболее перспективным препаратом для регенеративной медицины является созданный с помощью данной технологии препарат имГД — иммобилизированная на полиэтиленгликоле (пегилированная) гиалуронидаза.
Разработанное средство по степени активности и широте спектра действия не имеет аналогов. В отличие от известных препаратов обычной гиалуронидазы, эффекты которых в безопасных дозах ограничиваются преимущественно их местным действием, пегилированная гиалуронидаза обладает выраженными системными эффектами за счет устойчивости к сывороточным и тканевым ингибиторам фермента, подавляющими ее активность.
Кроме того, на сегодняшний день в научной литературе не описаны вещества, оказывающие столь выраженное влияние на разные функции прогениторных элементов и механизмы их регуляции.
Данное средство в очень низких дозах (1 ЕД/мышь), в том числе и при его пероральном применении, стимулирует процессы пролиферации и дифференцировки родоначальных элементов различных классов, а при экстремальных воздействиях вызывает еще и их выход в кровь и направленный хоминг в орган-мишень.
Развитие описанных феноменов со стороны родоначальных клеток сопровождается и выраженными терапевтическими эффектами.
Так, пятикратное введение имГД крысам в дозе 50 ЕД/кг после месячного введения токсичного патогена — тетрахлоруглерода — приводит практически к полной нормализации морфофункционального состояния печени.
Выявленный феномен послужил отправной точкой разработки оригинального универсального подхода повышения эффективности терапии различных заболеваний с помощью препаратов — аналогов эндогенных регуляторов функций (гормонов, цитокинов и др.) путем их комбинации с имГД.
Отметим, что при рассмотрении проблемы регенеративной медицины актуальным представляется значительное усиление специфически связанной с кроветворением активности Г-КСФ и эритропоэтина, а также гепатопротекторных свойств Г-КСФ. В то же время в наших экспериментах показано и аналогичное действие имГД в отношении других аналогов физиологических функций, в том числе и в отношении инсулина при инсулинонезависимом и инсулинозависимом сахарном диабете.
Таким образом, несмотря на то что имГ-КСФ и имГД обладают самостоятельной специфической активностью в отношении прогениторных клеток различных классов, в том числе воздействуют и на механизмы регенерации стволовых клеток тканей-депо, то есть механизмы регенерации «глубокого резерва», наиболее значимых терапевтических эффектов за счет реализации программ клеточного обновления удается добиться при их сочетанном использовании.
В целом представленные данные свидетельствуют не только о принципиальной возможности, но и, безусловно, о высокой перспективности проведения клеточной терапии иммобилизированными с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза модификаторами функций прогениторных клеток.