Цивилизация
– Александр, как сформировался ваш научный интерес к паукам? Стихийно или в этом была закономерность?
– Моя карьера линейна: кафедра биоорганической химии биологического факультета МГУ, Институт биоорганической химии. Пауки — вот уже более 30 лет основной научный интерес руководителя лаборатории, академика Евгения Васильевича Гришина, а последние 10 лет и мой. Евгений Васильевич знаменит своими классическими исследованиями,
в которых изучал яды черных вдов и кругопрядов, значительно на тот момент обогнав всех западных конкурентов.
Причем нас интересовали и интересуют яды не сами по себе, а как высокоточный инструмент воздействия на нервную систему человека.
– В обывательском представлении яд — это конкретное химическое вещество, например цианистый калий. А что представляет собой паучий яд?
– Если вы посмотрите, из чего состоит яд, скажем, пауков, и других групп ядовитых животных — скорпионов, змей, морских моллюсков конусов, ядовитых и очень опасных, а также морских анемон, или актиний, то окажется, что в составе одного яда может быть несколько тысяч самых разнообразных химических веществ, от солей до очень сложных белков. Но, как правило, природа отдает «предпочтение» какому-то одному классу соединений. В большей части исследованных случаев — функционально или по массе — это пептиды. У тех представителей, которых я назвал, «предпочтение» отдается именно пептидам.
– Это какие-то особенные пептиды?
– В большинстве случаев они родственны. И организованы в такие структуры, что, глядя на них, можно сказать, будто здесь комбинаторный химик поработал. Все эти соединения построены по общему принципу. В них есть определенный каркас, который консервативен, свойственен для всех этих пептидов. А остальные их элементы не просто разнообразны – они гипервариабельны. Но структура узнаваема: на извстный каркас навешиваются различные химические группы-заместители.
Получается своеобразная природная комбинаторная библиотека. Это в свой черед приводит к тому, что у каждого такого соединения есть своя собственная мишень, часто весьма специфичная. То есть конкретное соединение будет воздействовать только на данную систему, на конкретный вид рецепторов. Например, на потенциалчувствительный натриевый канал в нервном волокне. И ни на какие другие мишени воздействовать не будет.
А если мы рассмотрим все многообразие ядов в целом, то выяснится, что мы имеем дело с гигантской природной библиотекой соединений, и каждое из этих соединений подходит как ключ к замку к определенному типу рецепторов.
И вот идея последних десяти лет научной работы лаборатории заключается в том, что в этой природной библиотеке можно найти специфичный токсин для любой наперед заданной мишени. Вы можете выбрать в нервной системе рецептор, который вас интересует как исследователя, и среди природных ядов непременно найдете молекулу, которая будет воздействовать на эту самую мишень. Идея – научная догадка, которую мы последние несколько лет тщательно проверяем. На самом деле она несколько амбициозна, потому что не проистекает из общих соображений. Ну как так? Неужели действительно к любому рецептору природа создала свой токсин? Мы можем только результатами своих экспериментов подтвердить, что так оно и есть. Выбираем рецептор, который нам интересен, и ищем: получится–не получится. И сколько ни пробовали – получается…
– Какие же мишени оказались самыми интересными?
– Например, рецепторы, которые обуславливают возникновение и проведение болевых сигналов. Мы изучаем их последние несколько лет. Это специальные белки нервной системы, распознающие болевые стимулы. Их активация в конечном итоге и приводит к возникновению чувства боли.
– А почему именно болевые рецепторы и чем эти рецепторы отличаются от других?
– Мы сосредоточились на трех основных группах рецепторов боли. Первая – тепловые. Такие рецепторы организм задействует, когда человек горячей водой ошпарился или съел красный перец. Другая группа рецепторов включается при ожоге кислотой. Третья группа – рецепторы внеклеточного аденозинтрифосфата, АТФ. Существуют разные описательные термины для молекулы АТФ: молекула, запасающая энергию; «энергетическая валюта» клетки; донор химической энергии. АТФ – стандартный компонент клетки. Если он обнаруживается за пределами клетки, это означает, что ткань повреждена. И такой сигнал распознается как боль. Для этого есть специальные рецепторы.
Следует сказать, что работа была выполнена в сотрудничестве с лабораторией Олега Александровича Крышталя из Института физиологии им. А. А. Богомольца в Киеве. Он знаменитый нейрофизиолог, советский, а затем украинский. Одним из первых он показал, что АТФ может индуцировать нервный сигнал, и был первым, кто выяснил, что кислота, воздействуя на нейроны, продуцирует слабые электрические токи в мембране этих клеток. Слава открытия ионных каналов, которыми «управляет» кислота, принадлежит Крышталю.
Что касается актуальности такой работы, мы исходили из того, что анальгетики, которые присутствуют на фармрынке, характеризуются рядом недостатков; во всем мире ведется активный поиск новых обезболивающих; это очень важная область исследований и … давайте попробуем поискать к этим рецепторам боли токсины, чтобы их блокировать.
– А как нервные клетки распознают, что в других клетках произошла утечка АТФ?
– В окончаниях чувствительных нейронов есть специальные ионные каналы, которые открываются только в ответ на внеклеточный АТФ, а в результате возникает слабый электрический ток – потенциал действия, то есть нейрон «сигналит». Потенциал действия распространяется по нейрону дальше самостоятельно с участием натриевых и калиевых каналов. Принцип работы всех чувствительных нейронов сходный, различается лишь набор рецепторов, вовлеченных в распознавание раздражителя.
Утечка АТФ распознается достаточно быстро. Ее можно имитировать, сделав подкожную инъекцию АТФ. Довольно сильное чувство боли возникнет почти незамедлительно.
– Наверное, вы все же (хотя бы из любопытства) протестировали все три типа рецепторов на восприимчивость к ядам пауков?
– Мы исследовали все три группы рецепторов и действительно ко всем нашли яд-ключик. В то время в нескольких лабораториях по всему миру вели активные поиски в данном направлении. Это было своеобразное научное соревнование.
Где-то не мы победили, но с рецептором АТФ мы были первыми и до сих пор единственными. Пока что никому не удалось такого сделать. В яде паука-волка, среднеазиатского тарантула, мы нашли пептид, который блокирует рецепторы внеклеточного АТФ.
– Почему именно тарантул? Вы действовали методом простого перебора или сразу «поставили» на тарантула? И как это выглядит в реальности? У вас в лаборатории стоят ряды клеток, где сидят пауки разных мастей, и вы отбираете у каждого яд и тестируете?
– В некоторых зарубежных лабораториях так и происходит. Мы вывели этап отбора яда за пределы лаборатории. Этим занимаются специальные люди. Те, кто может выполнять процедуру эффективнее, чем мы. В Московском зоопарке, например, (с ними мы тоже сотрудничаем) выращивают для нас пауков и отбирают яд.
– То есть вы им звоните и говорите: сегодня нам нужен яд «черной вдовы» или паука-птицееда — и они готовят его для вас?
– Примерно так. А дальше происходит «дойка» паука, забор яда методом электростимуляции. И мне приходилось это делать, и среди нас есть люди, которые умеют это делать хорошо, но все же мы получаем в распоряжение уже готовый яд. В нашей коллекции более сотни таких ядов. Несколько десятков мы протестировали и выяснили, что на чувствительные болевые нейроны воздействуют лишь некоторые из них. Самое успешное продолжение получила история с тарантулом.
– Вроде он наш, родной. И в Московской области встречается…
– Да, это счастливое совпадение. Тот тарантул, из которого мы выделили это вещество, он не совсем южнорусский, это его близкий родственник из Казахстана. В яде нашего южнорусского есть вещество, близкое по свойствам. Более того, мы уверены, хотя пока еще это не проверяли, но это можно сделать, что механизм действия того токсина, который и в яде южнорусского тарантула содержится, будет сходным.
– А как вы проверяли действие токсина?
– Мы использовали в качестве тест-системы ооциты (яйцеклетки) шпорцевой лягушки. Помимо того что они крупные, и можно к ним электроды приладить, чтоб померить электрический ток, у ооцитов есть еще одна замечательная особенность. Она заключается в том, что эти клетки находятся в состоянии ожидания оплодотворения. Поэтому у них сильно подавлено производство собственных белков. Мембранных рецепторов, в том числе ионных каналов, очень мало. Ими можно пренебречь. И еще один плюс: какую бы матричную РНК (мРНК; РНК, с которой считывается информация о синтезируемом белке) вы бы туда ни поместили, с нее будет читаться белок. Мы помещали туда мРНК, которая кодирует интересующие нас рецепторы. И получается, что на мембране ооцита в конечном итоге оказываются те ионные каналы, которые нам нужны. А дальше мы вводим в клетку электроды и измеряем электрический ток, проходящий через мембрану в обычном состоянии и после добавления токсина. Если электрический ток изменяется, значит яд подействовал. А дальше мы яд фракционируем, находим индивидуальный компонент (из тысячи!) и определяем его структуру. Поскольку здесь речь идет о пептидах, надо «прочитать» их аминокислотную последовательность – просеквенировать. Потом мы воссоздаем нужный пептид методами генной инженерии, клонируем его ген в бактерии – кишечной палочке. Пептид нужен в ощутимых количествах (пауков столько не надоишь!) для того, чтобы сделать разнообразные тесты, а кроме того, если хочется, чтоб он в дальнейшем стал лекарством, его требуется много.
– То есть, чтобы в конечном итоге получилось лекарство для человека, в процесс вовлечены представители самых разных групп живых организмов – пауки, лягушки, бактерии. А мРНК чья?
– Поскольку боремся с человеческой болью, то для создания ионных каналов мы используем гены человека.
– Как далеко вы продвинулись в своих исследованиях на настоящий момент?
– Мы опубликовали статью в Annals of Neurology пару лет назад, а в настоящий момент эта работа находится уже на этапе доклинического исследования. Второй год мы проводим испытания препарата. Молекулу назвали «пуротоксин» – от словосочетания «пуриновые рецепторы», которые и активирует АТФ. Получили грант Минпромторга в рамках программы «Фарма-2020» на проведение дальнейших работ. Надеемся, что из этого пептида получится новое достаточно мощное анальгезирующее средство. Пока что, сравнивая его с аналогами, можно сказать, что оно действует гораздо сильнее.
– Современные анальгетики представлены самыми разнообразными классами химических соединений с различными механизмами действия. Среди них и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВС) из группы аспирина и алкалоиды, например морфин. Кстати, опиаты (и именно морфин) считаются золотым стандартом обезболивания — все новые анальгетики сравнивают именно с ним, поскольку традиционно он самый мощный. Вы проводили такое сравнение?
– Анальгетиков, взаимодействующих именно с пуриновыми рецепторами, не существует. Нет примеров, когда рационально были бы созданы лекарственные вещества, воздействующие на эти типы болевых рецепторов. Есть примеры, когда чисто случайно попутно так получилось. Например, НПВС помимо циклооксигеназы блокируют еще и кислоточувствительные каналы. Но это стало понятно лишь постфактум. Лекарств, блокирующих пуриновые рецепторы, нет. Механизм действия пуротоксина можно считать уникальным. Но впереди еще четыре стадии клинических исследований. Что касается сравнения с опиатами, то наши молекулы вызывают сходный эффект в болевых тестах в дозировках, которые в 100 раз ниже соответствующих дозировок морфина.
– И все-таки вы ведь свой белок из яда выделили — может, он токсичен? Или способен вызывать привыкание, как морфин?
– Токсичность мы оценили сразу же, на первых этапах доклинического исследования. «Терапевтическое окно» – разница между действующими дозами и токсичными – оказалось очень широким. По шкале токсичности наше вещество относится к предпоследнему классу токсичности. Не поваренная соль, но что-то около того. И уж тем более в терапевтических дозах токсичности мы не наблюдаем. Что касается привыкания, привыкание к опиатам связано с мишенью: их рецепторы в центральной нервной системе. В нашем случае мишень – периферическая нервная система.
– То есть в центральной нервной системе нет рецептора к вашему пептиду?
– Есть, но мы предполагаем, что наше вещество не преодолевает гемато-энцефалический барьер и не попадает в головной мозг, поскольку это сравнительно крупный пептид, состоящий из 35 аминокислот. Но мы будем проверять это дополнительно.
– Чужеродный белок — как организм его воспримет?
– Мы имеем дело с живыми системами, а у живых систем есть свойство приспосабливаться. Наверняка какие-то компенсаторные механизмы, обратные связи, существуют; возможна дополнительная активация или синтез новых пуриновых рецепторов в клетках. Скорее всего, такие обратные связи будут задействованы. И это надо исследовать. Иммуногенность мы сейчас тестируем, пока результаты весьма обнадеживающие.
– И последний вопрос. Вы установили пространственную структуру пептида — это помогает предсказывать какие-то неожиданные его свойства?
– Пространственную структуру пептида мы исследовали методом ядерного магнитного резонанса в лаборатории доктора химических наук Александра Сергеевича Арсеньева в ИБХ РАН. В основе молекулы каркас, который называется цистиновый узел. Оказалось, что такое ядро обуславливает высокую стабильность молекулы к действию протеолитических ферментов. Сейчас мы проводим доклинические исследования с внутривенными инъекциями, и у экспертов возник стандартный вопрос: если это пептид, то ферменты-протеазы должны его быстро расщепить и утилизировать. Однако этого не происходит. Благодаря цистиновому узлу пуротоксин приобрел колоссальную устойчивость к действию протеаз. Мы активно изучаем этот пептид и стараемся охарактеризовать все его сильные и слабые стороны.